猪源肠外致病性大肠杆菌Ⅵ型分泌系统基因vca0107基因缺失突变株的构建及生物学特性研究

【摘要】肠外致病性大肠杆菌(ExtraintestinalpathogenicEscherichiacoli,ExPEC)是一类能引起人畜肠外组织与器官感染的重要人畜共患传染病病原,可通过其特有的毒力因子(菌毛、粘附素、铁相关蛋白等)侵袭并定植于肠外的不同组织与器官,诱发不同宿主产生脑膜炎,败血症与泌尿道感染等症状。随着ExPEC对养猪业的危害以及相应的全球医疗业上巨额的财政支出,并且发现ExPEC的危害甚至高于广受关注的E.coli0157:H7,应该受到公共卫生意义上的广泛关注。人们对ExPEC的认识和研究越来越多,ExPEC可以通过食物源进行传播,饮用水与食物等污染可导致疾病的爆发,严重者,可危及人和动物的生命。对家畜业而言,该菌群能够导致家畜产生肺炎、肾炎、脑膜炎和败血症等病症。ExPEC是诱发猪产生肺炎和新生儿脑膜炎等症状的重要致病因子之一细菌的许多分泌性蛋白和毒素都是通过分泌系统而被运输到细胞体外或者直接运输到宿主细胞体内,然后与宿主细胞相互作用而使分泌蛋白和毒素发挥毒性。目前为止已经发现至少六种分泌系统(T1SS-T6SS),而T6SS虽然是最近几年发现的一种新型分泌系统,但是学者们对于T6SS的研究可以追溯到数十年前,而且经过基因组学分析发现已经测序的革兰氏阴性菌中有25%的都含有编码T6SS的基因,而且其保守度很高。T6SS通常是由12-25个亚基组成的,其中一些蛋白Vgrg、Hcp和VAS等的部分功能己经被证实,而其他大部分的蛋白功能尚且未知。本实验室对已经全基因测序的肠外致病性大肠杆菌强毒株PCN033与弱毒株PCN061进行基因组学和比较基因组学的分析,发现PCN061中没有编码T6SS的基因簇,表明T6SS在肠外致病性大肠杆菌致病过程中可能发挥重要作用,因此以本室分离的PCN033菌株为亲本菌,其血清型为O11,D群系,我们缺失T6SS中功能未知的基因vca-0107,构建vca-0107基因缺失突变株,研究其功能和生物学特性。主要内容包括：1.构建重组自杀性质粒参照PCN033全基因测序的结果设计vca-0107上下游片段的引物,扩增vca-0107基因的上下游同源臂。将得到的上下游片段同时连接pMD18-T载体,转化感受态细胞DH5a,经过PCR和双酶切双重验证正确,然后上下游片段先后连接中间转移质粒pBluescriptⅡSK(+)上,再次转化感受态细胞DH5a,经过PCR和双酶切验证正确之后,将成功连接的上下游连接片段连接到携带氯霉素抗性(Cm)的自杀性质粒pRE112上2.接合转移与筛选鉴定缺失株PCN33Δvca0107vca-0107上下游同源臂与自杀性质粒pRE112成功连接之后,将重组质粒转化到大肠杆菌X7213(生长时需加入DAP)中,PCR鉴定重组质粒成功转化后,以成功转化了重组自杀性质粒pREΔvca-0107的大肠杆菌X7213为供体菌,而亲本菌株PCN033则为受体菌进行接合转移,通过同源重组进行同源臂之间的交换。涂布含有氯霉素抗性的LA平皿,然后筛选对蔗糖敏感的接合子,进一步用PCR鉴定重组自杀性质粒已经整合到亲本菌株的染色体中。鉴定正确后,在LB培养基(不含NaCl)中培养传代促使第二次同源重组的发生。涂布无抗生素的LA平皿,利用氯霉素抗性筛选出Cm敏感(Cms)克隆,并进行PCR鉴定,确定发生了第二次交换,重组自杀性质粒已经丢失以及vca0107基因已经缺失。从而成功构建基因缺失株PCN033Δvca-0107。3.缺失株生物学特性的研究将缺失株和亲本株同时进行活菌涂板计数,绘制生长特性曲线图,结果表明,缺失株PCN33Δvca-0107与亲本菌比较,生长速度没有明显变化,说明vca-0107基因的缺失对PCN33的生长没有很大影响。测定亲本菌和缺失菌在4周龄昆明雌性SPF小鼠体内的毒力,根据公式计算LD50的值,结果显示,与亲本菌PCN033比较,基因缺失株PCN33Δvca-0107的毒力无明显变化。通过比较缺失株和野生株的细胞粘附入侵能力,发现粘附能力有变化,而入侵能力变化不大,比较其吞噬存活能力发现两者之间有明显的变化。
【作者】赵丽丽；
【导师】陈焕春；谭臣；
【作者基本信息】华中农业大学，预防兽医学，2014，硕士
【关键词】肠外致病性大肠杆菌；T6SS；vca0107；基因敲除；生物学特性；

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